發(fā)布日期：2018-04-02

　　新藥研發(fā)的失敗率之高是眾所周知的，以抗癌藥物為例，全美每年因為研發(fā)失敗損失的費用在8-14億美元之間。一方面，依靠動物實驗獲得臨床前數(shù)據(jù)來預(yù)測藥物的藥效、毒性以及在人體中的PK(藥代動力學(xué))參數(shù)，是新藥研發(fā)過程中的“標準操作”。但是由于動物和人的種屬間差異，不可避免的造成預(yù)測偏差，導(dǎo)致很多藥物臨床前和臨床試驗的橋接失敗，最終導(dǎo)致開發(fā)失利。另一方面，以體外細胞模型來替代動物實驗，當前的體外模型主要依靠二維或者簡單的三維細胞培養(yǎng)體系，簡單快速高通量是它的優(yōu)勢，廣泛用于早期化合物的篩選。但是這種通過培養(yǎng)皿和多孔板培養(yǎng)出的簡單細胞模型生理功能不完整，并且沒有考慮組織間的相互作用，并不能夠準確反映生理狀態(tài)下的機理，對化合物的選擇構(gòu)成誤導(dǎo)。因此，不論是動物實驗還是體外實驗，都很難準確預(yù)測藥物在人體中的行為。行業(yè)迫切需要與生理功能更相關(guān)，精準性更高的藥物篩選平臺。

　　上世紀90年代，研究微全分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis Systems, μTAS)的科學(xué)家們提出了基于微流控技術(shù)的器官芯片(organ-on-a-chip)概念。做為一種潛在的細胞試驗新型工具，在器官芯片研究之初主要是將概念落地，還遠沒有達到實際應(yīng)用的目標。近年來，隨著技術(shù)的成熟，越來越多的資金投入到這一領(lǐng)域，應(yīng)用前景也明朗起來。本文對器官芯片目前的技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，以及如何參與藥物研發(fā)和應(yīng)用中遇到的問題做了整理。

　　微流控技術(shù)和細胞擦出的靈感

　　微流控技術(shù)整合了微米/納米技術(shù)、化學(xué)感應(yīng)器和分析化學(xué)技術(shù)。微流控裝置通常由像照平印法或軟印法等半導(dǎo)體微制造技術(shù)制成，可以用于微通道或微結(jié)構(gòu)的化學(xué)分析，又被稱為“芯片實驗室”(Lab-on-a-chip)。就像上面所述，體外細胞評價體系存在細胞失活和生理功能缺失等不足，即使是原代培養(yǎng)細胞也有這些現(xiàn)象。同時，經(jīng)典方法的細胞培養(yǎng)環(huán)境是相對靜態(tài)的，待測藥物加樣后主要通過被動擴散進入細胞，這與體內(nèi)的真實情況差別較大。在體內(nèi)細胞既可以通過血液獲得氧氣和營養(yǎng)，也會接受化學(xué)和生理的刺激，比如其微環(huán)境帶來的細胞拉伸和剪應(yīng)力等。

　　這些體內(nèi)外從形態(tài)到環(huán)境的差異導(dǎo)致了所培養(yǎng)細胞系的功能缺失，為了填補這一巨大空隙，從2000年開始μTAS和組織工程學(xué)的研究人員聯(lián)手開發(fā)基于微流控技術(shù)的細胞裝置，充分發(fā)揮其具有液體共振、細胞粘附、機械刺激等優(yōu)勢來復(fù)制組織功能，形成了現(xiàn)在的器官芯片的雛形。近年來微制造、細胞工程學(xué)、成像技術(shù)的發(fā)展幫助器官芯片成為體外仿生的創(chuàng)新技術(shù)，吸引了美國NIH、FDA、歐洲和日本等政府和機構(gòu)的資金支持。特別是隨著誘導(dǎo)性多能干細胞(iPS)技術(shù)的發(fā)展，將器官芯片作為組織模型或疾病模型已廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)中。

　　器官芯片的應(yīng)用

　　目前已有的器官芯片包括肺、肝臟、腎臟和腸道，下面一一介紹。

　　芯片肺

　　芯片肺在器官芯片中發(fā)展的最早，這種微流控細胞裝置又被稱為“會呼吸的肺”。哈佛大學(xué)的Ingber研究團隊發(fā)明的芯片肺主要包括一個雙層通道結(jié)構(gòu)，由硅樹脂和多聚二甲基硅氧烷組成的微孔膜垂直隔開。膜的上層是肺泡上皮細胞，下層是血管內(nèi)皮細胞，分別給予流動空氣和培養(yǎng)基來。除了復(fù)制肺細胞的功能，這層微孔膜還可以在兩側(cè)通道內(nèi)部壓力改變的作用下做周期性的收縮，模擬肺泡在呼吸時的生理性舒張和收縮運動。利用這種芯片肺，研究人員發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在暴露于TNF-α和細菌環(huán)境下能夠做出炎癥應(yīng)激并高表達ICAM-1。在另一項毒性評價中，微膜在舒展狀態(tài)下，納米微粒能夠更多的攝取到血管一側(cè)，這與動物實驗的觀察一致。以上研究都表明芯片肺作為體外疾病模型可以滿足新藥開發(fā)的需求。

　　芯片肝臟

　　肝臟在藥物代謝過程中所發(fā)揮的重要作用不需贅述，新藥開發(fā)過程中準確預(yù)測肝臟對藥物的代謝能力和藥物在肝臟中的毒性蓄積非常重要。目前的體外實驗中所用肝細胞的酶活和功能有缺失。Powers的研究團隊用微流控技術(shù)構(gòu)建了三維形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的芯片肝臟，并使其處于持續(xù)的灌注狀態(tài)下。這一裝置的每個通道由一個具有留存細胞功能的濾膜和一個細胞培養(yǎng)腔體組成，培養(yǎng)基從上至下灌注每一個通道。根據(jù)估算出的細胞耗氧值設(shè)置流速，以提供符合生理范圍的流體剪應(yīng)力。研究證明這種芯片肝臟能夠使細胞聚集生成肝腺泡結(jié)構(gòu)，并在兩周內(nèi)保持結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的生理功能。

　　除了結(jié)構(gòu)要盡量仿生，保持肝細胞的極性轉(zhuǎn)運能力也很重要。以中央靜脈為中心，肝細胞呈放射狀排列成肝細胞索，相鄰的肝細胞之間有膽小管，膽汁通過膽小管匯集起來最終通過膽管排泄。膽汁中有很多在肝臟中生物轉(zhuǎn)化而來的藥物代謝產(chǎn)物，經(jīng)過膽管排泄。因此，膽汁排泄在藥物代謝體外研究中是個重要內(nèi)容。Nakao和他的團隊發(fā)明了一個體外肝小葉模型裝置，可以復(fù)制肝細胞索的功能。這個裝置的細胞培養(yǎng)區(qū)將肝細胞平行排成兩列，形成與肝細胞索相似的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)這些整齊排列的細胞能夠沿著細胞索生長形成膽管結(jié)構(gòu)。研究人員利用藥物CDFDA來測試該芯片的代謝功能，CDFDA能夠在肝酯酶的作用下代謝為一種熒光產(chǎn)物CDF，再通過膽汁排泄。載有CDFDA的培養(yǎng)基流過該裝置的血管通道后，在細胞形成的“膽管”結(jié)構(gòu)中檢測到了CDF。這一結(jié)果證明應(yīng)用微流控技術(shù)制造的芯片肝臟可以模擬組織形態(tài)及相應(yīng)的生理功能。

　　基于微流控技術(shù)的各器官芯片(圖片源自參考文章)

　　芯片腎臟

　　腎臟在體內(nèi)負責藥物代謝和排泄。在臨床前篩選階段，評價候選化合物的腎臟蓄積和毒性通常要做動物體內(nèi)實驗，目前還沒有更好的體外模型。由種屬腎毒性差異造成的藥物失敗也不在少數(shù)，發(fā)展出高效準確的體外腎毒性評價體系是新藥研發(fā)迫切需要的。進一步說，如果有一個體外模型不僅能夠預(yù)測腎毒性，還能反應(yīng)腎臟疾病背后的機理，用于相關(guān)藥物的篩選，則是更好不過了。

　　時下的芯片腎臟是在芯片微通道底層鋪就MDCK細胞系和人源HK-2細胞系，再施以相應(yīng)的剪應(yīng)力。研究表明這種細胞構(gòu)造可以逐漸呈現(xiàn)厚度增加，Na/K ATP酶表達提高和纖毛形成，基本達到模擬腎細胞生理功能的目的。另一種模擬腎小管重吸收的微孔膜芯片模型，是通過在基底側(cè)通道加入vasopressin和aldosterone等激素，制造基頂側(cè)包括鹽濃度和滲透壓改變的生理應(yīng)激。研究人員發(fā)現(xiàn)剪應(yīng)力不僅能調(diào)整細胞生長方向，還能促進Pgp蛋白的表達、纖毛生長和細胞白蛋白葡萄糖的吸收。Musah團隊利用微流控技術(shù)和人源iPS衍生的足狀突細胞復(fù)制了腎小球結(jié)構(gòu)。能夠模仿包括剪應(yīng)力的生理功能，可以作為體外腎臟模型篩選癌癥藥物。以上結(jié)果說明即便結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜如腎臟，利用微流控芯片技術(shù)也能得到保持基本腎臟功能的體外模型。

　　芯片腸道

　　作為主要負責消化和吸收的組織器官，腸道特別是小腸對口服藥物起到屏障的作用，預(yù)測其吸收功能對新藥研發(fā)十分重要。Kimura的研究團隊發(fā)明了一種搭載光探測系統(tǒng)的小腸芯片裝置。包括兩個膜上培養(yǎng)Caco-2細胞的微孔膜隔開的獨立腔體，該腸芯片具有轉(zhuǎn)運體功能，可以評價藥物的吸收，但是生理功能不完整。Kim的研究團隊發(fā)明的芯片腸道能夠模擬剪應(yīng)力和周期性拉伸等生理刺激，暴露在這種仿生環(huán)境里的Caco-2細胞能夠自發(fā)生長出絨毛并進行細胞分化。為了復(fù)制更復(fù)合體內(nèi)的生理環(huán)境，研究人員又將這一系統(tǒng)的腸道細胞與很多共生菌一起孵育。改進的芯片腸道能夠得到與之前動物實驗或人體實驗相同的結(jié)果，表明芯片腸道可以作為腸道生理功能和疾病機理評價的體外平臺。

　　“身體”芯片

　　利用微流控技術(shù)制備器官芯片是一回事，將不同器官芯片再相互關(guān)聯(lián)，組成更復(fù)雜的“身體”芯片又是另一回事，因為想要精準預(yù)測各組織器官間的相互作用是很困難的。類似的裝置已經(jīng)有所嘗試，利用這種芯片可以得到藥物連續(xù)的PK和ADME(吸收、分布、代謝和排泄)數(shù)據(jù)，并利用這些參數(shù)建模來預(yù)測藥物在人體中的代謝過程。

　　Shuler和他的同事從事生物工程領(lǐng)域前沿研究，他們發(fā)明了一種包括多個組織腔室，將不同組織細胞共同培養(yǎng)的身體芯片，稱為uCCA (micro cell culture analog)。研究人員利用該芯片系統(tǒng)對比了抗腫瘤藥物Tegafur在PO和IV兩種給藥途徑下的組織器官間相互作用，結(jié)果證明該系統(tǒng)可以很好的得出與動物實驗相似的數(shù)據(jù)。Imura的研究團隊也制造了另一款身體芯片，集成了小腸細胞的吸收功能，肝臟細胞的代謝功能，腎臟細胞的排泄功能。利用該芯片對一系列不同吸收程度和治療機制的抗腫瘤藥物進行了對比實驗，得到的藥效差異證明了裝置的可行性。雖然以上芯片裝置模擬了器官間的相互關(guān)聯(lián)，但是獲得的參數(shù)不能直觀反映生理功能。Kimura的研究團隊制造的身體芯片納入了體內(nèi)的各項生理參數(shù)，比如組織容積比和血流量等，可以用于抗腫瘤藥物藥效評價。

　　基于PBPK原理打造的“身體”芯片(圖片源自參考文章)

　　必須承認的是，這些身體芯片技術(shù)還遠稱不上成熟，它們不能夠復(fù)制所有體內(nèi)的生理功能。其實身體芯片的重要意義到不在于真的創(chuàng)造一個復(fù)雜的“微型人體”，而是利用體外技術(shù)來揭示藥物在體內(nèi)各器官間的相互作用和代謝轉(zhuǎn)化途徑，并利用獲得的參數(shù)建模預(yù)測藥物體內(nèi)過程。換而言之，身體芯片需要與PK模型合用來預(yù)測和解釋機理及現(xiàn)象。以上所介紹的身體芯片可以應(yīng)用于不同的藥理毒性研究，通過引入不同細胞和基質(zhì)來獲取數(shù)據(jù)，再結(jié)合數(shù)學(xué)模型來構(gòu)建PK預(yù)測的評價體系。

　　器官芯片發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)

　　盡管發(fā)展迅速，但是器官芯片還不能代替動物實驗，在芯片技術(shù)和生物機理兩個方面都有各自的瓶頸。首先是器官芯片檢測技術(shù)的短板，時下的評價體系無外乎直接觀察或者測量功能參數(shù)。但是最有應(yīng)用價值的體外模型應(yīng)該是具備觀察和記錄對不同生物刺激信號產(chǎn)生特定生理應(yīng)答的系統(tǒng)。因此我們需要繼續(xù)發(fā)展檢測技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)，使得在微流控裝置的微縮空間內(nèi)能夠更好的完成生物化學(xué)分析。其次，復(fù)雜的微流控芯片制備過程也限制了這一技術(shù)的發(fā)展，只有實現(xiàn)自動化制備，器官芯片才能真正推廣開來。此外，還有一個生物學(xué)問題就是細胞系的來源，目前使用的永生細胞系多是來源于組織功能缺失的腫瘤細胞；原代人源細胞的使用雖然能夠相對準確的預(yù)測PK參數(shù)，但是也有捐贈來源和花費的問題。也許將來人源iPS誘導(dǎo)細胞的廣泛使用可以彌補這方面的不足。

　　雖然時至今日，尚無器官芯片在藥物開發(fā)中成功應(yīng)用的例子，但是器官芯片無疑是一個很有應(yīng)用前景的藥物開發(fā)輔助工具。交叉技術(shù)的發(fā)展往往面臨相同的問題，那就是跨學(xué)科的技術(shù)溝通。就像器官芯片的研發(fā)，生物科學(xué)家知道問題出在哪里，但是不知道如何解決；而工程技術(shù)人員知道如何制造芯片，但是他們并不知道它能夠解決什么問題。只有將醫(yī)學(xué)、制藥、生物和工程學(xué)各領(lǐng)域的技術(shù)整合，才能讓器官芯片百尺竿頭，更進一步，更好的為人類健康服務(wù)。

　　參考文章：

The Homunculus metaphor Revisited In DrugDiscovery: Body-on-a-Chip.

Organs-on-a-chip: A new paradigm for toxicological assessment and preclinical drug development.

The Homunculus metaphor Revisited In DrugDiscovery: Body-on-a-Chip

來源：藥渡